《刀马旦粤语》以民国初年为背景，当时政局动荡、军阀混战，百姓生活苦不堪言。一张意外遗落的藏宝图，令袁世凯部下的督军、日本特务以及革命党人等多方势力暗中展开追查。南方政府特务沈玉茹（周慧敏饰）为寻找藏宝图的下落，乔装潜入戏班，却在各方争夺中亲眼目睹父亲遭枪杀。悲痛万分的她意外失足，醒来后失去记忆，只能流落街头。
小四喜坤班师傅沈铁兰（罗乐林饰）率团返回北平途中救下玉茹，并将她收为徒弟，改名沈菊仙。自此，她与师姐尚菊笙（梁佩玲饰）、张菊秋（许秋怡饰）及阮菊玲（何美钿饰）成为同门姐妹。然而，几位师姐对这位新来的菊仙抱有成见，处处排挤和为难她。一次偶然的相遇，让菊笙对富家少爷乔浩光（陈锦鸿饰）暗生情愫，可浩光早已对菊仙一见钟情，令两姐妹之间的矛盾进一步加深。
后来，菊仙得到当时的花旦名角梅芷苓（罗文饰）和高一鸣（盖鸣晖饰）的提携，终于与众师姐妹携手令女京戏班扬眉吐气。与此同时，菊仙尘封已久的记忆也开始逐渐恢复。
