上错花轿之三嫁奇缘将故事设定在大明万历九年。杭州举办“新派相亲”活动，董其昌与陈继儒前往杭州寻找好友江怀一，途中遭遇劫匪，幸得林天素出手相救。活动期间，董其昌与林天素的闺蜜杨云友情投意合，眼看就要相亲成功，却被衙门的人突然带走。得知杨云友的真实身份是“瘦马”后，董其昌深受打击。
杨云友被迫离家出走，途中遇见董其昌同父异母的弟弟是空。是空觊觎杨云友的美貌，又得知她是董其昌的爱人，便心生歹念，找来街头混混黄天监冒充董其昌，企图与杨云友成婚，最终计划失败。怀恨在心的 is空一路追到京城，试图绑架杨云友，却反被告到京城衙门。
此时，赴京任职的董其昌被张居正之女张希真看中。张希真发现董其昌心中始终只有杨云友，便与是空勾结，追杀杨云友。得知张希真的所作所为后，杨云友为了保全董其昌，决定嫁给别人，让他彻底死心。是空追到杭州并准备炸药，意图置人于死地，杨云友和董其昌也再次陷入危局。
